教科书上知识告诉我们，生物大分子DNA和RNA都是由四种基本碱基单元组成：DNA含有腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T），而RNA则是将胸腺嘧啶替换为了尿嘧啶（U）（图1）。

                图1. 生物大分子DNA和RNA的基本组成与化学结构

但是随着近几十年来的研究发现在DNA和RNA的碱基上存在着一些天然化学基团修饰，DNA修饰种类较少，RNA修饰较丰富，他们在调控生物体细胞内基因表达方面发挥重要的作用。分子生物学中心法则中间层次信使RNA（mRNA）上已被鉴定含有多种化学碱基修饰（图2）¹，其生物学功能还在不断的探索和挖掘中。然而，随即而来的重要科学问题是我们如何鉴定这些化学修饰的碱基在RNA上的精确位置，这是研究其生物学意义的分子基础。

            图2. mRNA上的转录后化学修饰及其在mRNA上的分布（图片来源Nat Rev Mol Cell Biol）

在迄今为止已经鉴定的150多种RNA化学修饰中，m⁶A（N⁶-甲基腺嘌呤）修饰是哺乳动物细胞信使RNA (mRNA)内部丰度最高的碱基化学修饰 (3-5 m⁶A/mRNA)，其生物学功能研究也最为广泛，近乎影响RNA代谢寿命过程中的每一个环节，包括转录、剪接、降解、翻译和运输等。这些研究成果的取得都得益于m⁶A检测和测序技术的发展， 为了深入理解m⁶A甲基化的功能，单碱基分辨率信息是必需的，它能在碱基层次上帮助我们理解细胞内甲基化的机理和功能。

2020年4月27日，浙江大学高分子科学与工程学系刘建钊课题组在Nature Chemical Biology上长文发表题为A metabolic labeling method detects m⁶A transcriptome-wide at single base resolution的研究，报道了一种称为m⁶A-label-seq的高通量测序方法，通过细胞自身代谢对全转录组RNA m⁶A位点进行标记，进而实现单碱基分辨率测定。

细胞内S-腺苷甲硫氨酸（SAM）是甲基转移酶的辅助因子，可在mRNA m⁶A甲基转移酶(METTL3/METTL14)的作用下，将其甲基转移到mRNA上的特定腺嘌呤的N⁶位点形成m⁶A。SAM是以甲硫氨酸和三磷酸腺苷（ATP）为原料，在甲硫氨酸腺苷转移酶（MAT）的催化下合成的。作者从甲基化源头考虑，引入带有烯丙基修饰的甲硫氨酸，在细胞内MAT作用下生成烯丙基取代的辅助因子allyl-SAM或者硒代同源物allyl-SeAM (图3)。 细胞内METTL3/METTL14利用allyl-SAM或allyl-SeAM，将其烯丙基修饰到mRNA上原本是m⁶A的位点，得到a⁶A（N⁶-烯丙基腺嘌呤），a⁶A在温和的碘加成条件下诱导生成环化1,6位环化腺嘌呤(cyc-A) (图3)，然后，RNA cyc-A在逆转录成互补DNA（cDNA）时发生碱基错配²。 最后，借助高通量测序和生物信息学分析突变位点，得到了全转录组m⁶A位点的单碱基分辨率图谱。

      图3. 示意图描述利用代谢标记测定RNA m⁶A精确位置的方法（图片来源Nature Chemical Biology）

刘建钊课题组利用m⁶A-label-seq方法对人体HeLa和HEK293T细胞系以及老鼠H2.35细胞系的mRNA m⁶A位点、位点距离、m⁶A共有基序等信息进行了系统分析。结果显示部分检测到的m⁶A修饰位点倾向于成簇出现，相邻m⁶A位点之间的中位距离约为50 nt（图4a）。并且，对A至C/T/G的突变位点进行序列分析，绝大部分共有序列为GGAC，与之前报道的m⁶A序列相符（图4b）。此外，以HeLa细胞为例，选取了FRAT2、ZNF445、LATS1等11种基因的14个位点，展示了高通量测序下的突变位点，该位点即为m⁶A位点（图4c）。研究人员还对选取的位点进行了低通量方法测序验证，以此确认这些位点的可靠性（图4d）。 

         图4. m⁶A-label-seq用于高通量测序鉴定m⁶A位点（图片来源Nature Chemical Biology）

为了进一步确认该方法的有效性，研究人员还将m⁶A-label-seq与miCLIP-seq、m⁶A-REF-seq、DART-seq等已知测序数据进行了对比，分析了各种方法之间鉴定的mRNA m⁶A位点重叠和差异比例情况。最后，研究人员选取了16个m⁶A特征位点，用独立正交的SELECT³ m⁶A鉴定方法验证了这些位点的可靠性。

综上，该研究的测序方法特点如下：（1）利用代谢对甲基化位点的源头标记并直接单碱基分辨率测定，相对于当前的间接方法有更高的准确率；（2）适用于细胞内RNA多种不同甲基化序列(motif)的鉴定；（3）对测定m⁶A簇修饰有优势。该方法为将来研究细胞核内种类繁多的新生RNA的m⁶A甲基化位点及状态演变提供了重要工具。另外，该方法在标记产率和标记时间窗口尺度方面还需要优化提高，为研究更多的细胞事件过程提供便利。

浙江大学高分子科学与工程学2017级直博生舒潇与2016级直博生曹婕同学为本论文的共同第一作者，刘建钊研究员为通讯作者。通讯作者同时也是浙江大学生命科学研究院兼职PI。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41589-020-0526-9

参考文献

1. Lewis, C., Pan, T. & Kalsotra, A. RNA modifications and structures cooperate to guide RNA–protein interactions. Nat Rev Mol Cell Biol 18, 202–210 (2017).

2. Shu, X. et al. N⁶-allyladenosine: a new small molecule for RNA labeling identified by mutation assay. J. Am. Chem. Soc. 139, 17213-17216 (2017).

3. Xiao, Y. et al. An elongation- and ligation-based qPCR amplification method for the radiolabeling-free detection of locus-specific N⁶-methyladenosine modification. Angew. Chem. Int. Ed. 57, 15995-16000 (2018).